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赭曲霉毒素A（Ochratoxin A）ELISA檢測試劑盒說明書

【概要】

赭曲霉毒素A （Ochratoxin A）是曲霉屬和青霉屬的真菌形成的次級代謝產(chǎn)物，屬烈性的腎臟毒和肝臟毒，廣泛存在于各種食物中。谷物及其副產(chǎn)品是赭曲霉毒素A的主要來源。動物實驗表明攝入了被這種毒素污染的飼料后，會發(fā)生急性或慢性中毒癥。防止污染赭曲霉毒素A的食品和飼料直接或間接地進入人類食物鏈，加強對赭曲霉毒素A的檢測十分重要。

【適用范圍】

可定性、定量檢測谷物、飼料、面粉、啤酒、紅酒、飲料等樣本中的赭曲霉毒素A。

【試驗原理】

本試劑盒采用競爭ELISA，在微孔板上預包被赭曲霉毒素A抗原，加入樣本/赭曲霉毒素A標準品溶液及辣根過氧化物酶標記的赭曲霉毒素A抗體。樣本或標準品溶液中的赭曲霉毒素A與預包被在微孔板上的赭曲霉毒素A抗原競爭結合辣根過氧化物酶標記的赭曲霉毒素A抗體。未結合的酶標抗體在洗滌時被除去，再加入顯色液，讀取吸光值。樣本的吸光值與其所含殘留物赭曲霉毒素A抗原的含量成負相關。對照標準曲線，即可得出相應殘留物赭曲霉毒素A的含量。

【試劑盒靈敏度】

   試劑盒靈敏度：1ppb

【交叉反應率】

   結構類似物                                                          交叉反應率

  赭曲霉毒素A   ……………………………………………………………  100%

  赭曲霉毒素B   ……………………………………………………………   43%

  赭曲霉毒素C   ……………………………………………………………     5%

【試劑盒組成】

1. 96孔板×1塊

2. 標準液×6瓶：（2ml/瓶）

0ppb, 1ppb, 3ppb, 9ppb, 18ppb, 54ppb

3. 酶標物 1瓶   …………………………………… 7ml

4. 顯色液1瓶   …………………………………… 12ml

5. 終止液1瓶   …………………………………… 10ml

6. 濃縮洗滌液（10×）1瓶 …………………… 50ml

7. 濃縮樣品稀釋液（10×）1瓶……………… 20ml

【需要而未提供的設備及試劑】

設備：

---微孔板酶標儀450nm

---振蕩器

---粉碎機

---離心機

---微量天平

---微量移液器：單道 20μl～200μl、200μl～1000μl、多道 300μl

試劑：

---去離子水（或蒸餾水）

---二氯甲烷

---鹽酸

---NaHCO3

【試劑配制】

1. 樣品稀釋液：將濃縮樣品稀釋液用去離子水按1:9體積比進行稀釋（1份濃縮樣品稀釋液+9份去離子水）。

2. 洗滌工作液：將濃縮洗滌液用去離子水按1:9體積比進行稀釋（1份濃縮洗滌液+9份去離子水）。

【樣品前處理步驟】

一、谷物與飼料（稀釋倍數(shù)：2.5）

1. 稱取1g粉碎的樣品，加入0.5ml 0.13M NaHCO3，震蕩1min，

2. 加入2ml樣品稀釋液，震蕩5min；

3. 室溫下，2000g離心15min；

4. 取100μl待測。

二、果汁、啤酒、飲料（稀釋倍數(shù)：1）

1. 碳酸飲料應去除CO2（60℃水浴或振蕩去除）

2. 取2ml 樣品，加入 1ml 1mol/L HCl 振勻，加入2ml CH2Cl2 振勻 3min；

3. 室溫下，3500g離心10min；

4. 去除上層液，吸取下層1ml,加入800μl樣品稀釋液，強烈振蕩3min；

5. 室溫下，3500g離心10min；

6. 取480μl上層液，加入120μl甲醇，振蕩均勻，取100μl待測。

【檢測步驟】

一、 測定前須知：

1. 使用之前將所有試劑和所需板條回溫（20～25℃）。

2. 使用之后立即將所有試劑及剩余板條放置2～8℃，干燥環(huán)境保存有利于保持試劑穩(wěn)定性。。

3. ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA操作中的要點。

4. 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。

二、操作步驟：

1. 將所需試劑及微孔板取出，放置室溫（20～25℃）30min以上，液體試劑使用前均須搖勻。

2. 取出所需數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板與干燥劑一起重新真空密封，放置于2～8℃。不可冷凍。

3. 洗滌工作液在使用前也需回溫。

4. 將樣本和標準品對應微孔編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

5. 加標準品/樣本50μl到對應的微孔中，加入酶標物50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應15min。

6. 小心揭開蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300μl/孔，洗板5次，每次間隔30s，用吸水紙拍干。

7. 加入顯色液100μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應15min。

8. 加終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設酶標儀于450nm處讀取每孔OD值。

【結果判定】

1. 百分吸光率的計算

標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0(ppb)標準溶液的平均吸光度值

2. 標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，赭曲霉毒素A標準品濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中赭曲霉毒素A實際量。

【注意事項】

1. 室溫低于20℃或試劑及樣本沒有恢復到室溫（20～25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2. 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

3. 每種試劑使用前均需搖勻。

4. 反應終止液為0.5M硫酸，避免接觸皮膚。

5. 不要使用過了有效期的試劑盒；也不要摻雜使用過了有效期的試劑盒；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

6. 儲存條件：

試劑盒保存于2～8℃，不能冷凍，將不用的微孔板重新真空密封。標準物質(zhì)和無色的顯色劑對光敏感，因此要避光保存。

7. 試劑變質(zhì)的跡象：

顯色試劑有任何顏色表明顯色劑變質(zhì)，應當棄之。0標準的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8. 加入顯色液后，一般顯色時間為15～30min。若顏色較淺，可延長反應時間到35min（或更長），但不得超過40min。反之，則減短反應時間。

9. 該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【樣品最低檢測限】

   谷物、飼料  ……………………………………………  2.5ppb

   果汁、啤酒、飲料  ……………………………………   1ppb

【貯藏條件及保存期】

貯藏條件：保存試劑盒于2～8℃。

保存期：該產(chǎn)品有效期為12個月。